스플라이싱 변이는 위치만 보고 끝내기 어렵습니다. canonical splice site, near-splice, deep intronic, exonic regulatory 변이를 SpliceAI, RNA assay, ACMG/ClinGen 기준과 함께 읽는 법을 정리합니다.
SpliceAI는 deep neural network (잔차 CNN, 10,000 nt 수용 영역)를 이용해 각 뉴클레오타이드 위치가 donor 또는 acceptor 자리로 사용될 확률을 예측합니다. 변이의 delta score는 참조 서열 대비 스플라이싱 변화량을 나타냅니다.
| Score | 의미 | 해석 |
|---|---|---|
| DS_AG | Acceptor Gain delta score | 새로운 acceptor 부위 생성 가능성 (cryptic 3'SS) |
| DS_AL | Acceptor Loss delta score | 기존 acceptor 부위 약화/소실 가능성 |
| DS_DG | Donor Gain delta score | 새로운 donor 부위 생성 가능성 (cryptic 5'SS) |
| DS_DL | Donor Loss delta score | 기존 donor 부위 약화/소실 가능성 |
최종 보고 점수 = MAX(DS_AG, DS_AL, DS_DG, DS_DL). 각 점수는 0–1 범위.
| Delta Score | ClinGen 해석 | 임상적 의미 | ACMG 기준 지원 |
|---|---|---|---|
| < 0.2 | Low impact | 스플라이싱 영향 가능성 낮음 | BP4 지원 |
| 0.2 – 0.5 | Moderate impact | 스플라이싱 영향 가능성 있음 — RNA 검증 권장 | 단독으로는 분류 기준 미충족 |
| 0.5 – 0.8 | High impact | 스플라이싱 영향 높음 | PP3 지원 |
| ≥ 0.8 | Very high impact | 스플라이싱 강하게 교란 — 병원성 가능성 높음 | PS3 수준 지원 (RNA 실험 병행 시) |
Pangolin (Zeng et al. 2022)은 GTEx 53개 조직의 조직 특이적 스플라이싱 데이터로 훈련된 SpliceAI의 확장 모델입니다.
관심 조직과 스플라이싱 맥락이 다를 때 씁니다. 예를 들어 뇌 특이적 isoform이 중요한 NDD 관련 변이라면, Pangolin의 뇌 조직 점수가 SpliceAI보다 더 직접적인 단서를 줄 수 있습니다.
Richards et al. 2015 ACMG 기준과 Abou Tayoun et al. 2018 (ClinGen Splicing Subcommittee) 가이드라인을 따릅니다. 스플라이싱 변이는 PVS1 기준이 핵심입니다.
| 기준 | 이름 | 강도 | 스플라이싱 변이 적용 |
|---|---|---|---|
| PVS1 | Null variant | Very Strong Pathogenic | Canonical ±1,2 변이 + NMD 감수성 전사체 + LOF 질환 메커니즘 확인 시. 조건에 따라 VS/S/M으로 등급 조정 (Abou Tayoun 플로우차트) |
| PS3 | Functional studies | Strong Pathogenic | RT-PCR, minigene, RNA-seq 등으로 스플라이싱 이상 실험적 확인 |
| PM2 | Absent from controls | Moderate Pathogenic | gnomAD 등 대조군 데이터베이스에서 극히 드문 변이 |
| PP3 | Computational evidence | Supporting Pathogenic | SpliceAI ≥ 0.5, MaxEntScan 점수 감소, CADD-Splice 높음 등 |
| BS3 | Functional — benign | Strong Benign | 실험으로 정상 스플라이싱 확인 |
| BP7 | Synonymous — no splice impact | Supporting Benign | 동의어 변이 + SpliceAI < 0.1 + 스플라이스 부위와 무관 |
| BA1 | Common in population | Stand-alone Benign | gnomAD MAF > 5% → 단독으로 양성 분류 |
PVS1 강도 결정 순서:
| 조건 | PVS1 강도 |
|---|---|
| NMD 감수성 + LOF 유전자 + 관련 전사체 | Very Strong (PVS1) |
| NMD 감수성이지만 전사체 관련성 불확실 | Strong (PVS1_Strong) |
| Skip이지만 in-frame + 중요 도메인 포함 | Strong |
| Skip이지만 in-frame + 도메인 중요성 불명 | Moderate (PVS1_Moderate) |
| Cryptic SS + NMD 불확실 | Supporting (PVS1_Supporting) |
스플라이싱 변이 하나가 여러 RNA 결과를 동시에 만들 수 있습니다. 실제 결과는 RT-PCR 또는 RNA-seq으로 확인해야 합니다.
해당 exon 전체가 mRNA에서 빠지는 결과입니다. Out-of-frame skipping은 NMD로, in-frame skipping은 단백질 기능 변화로 이어질 수 있습니다. 가장 흔한 스플라이싱 변이 결과입니다.
인트론이 mRNA에 남는 결과입니다. 보통 PTC 도입 → NMD로 이어집니다. 약한 스플라이스 부위 변이 또는 ESE 파괴 때 생기며, 일부 경우에는 기능적 단백질 변이체를 만들기도 합니다.
기존에 쓰이지 않던 스플라이스 부위가 활성화되는 결과입니다. 딥 인트로닉 변이의 주요 메커니즘이며, 새로운 exon(pseudoexon) 삽입이나 exon 연장/단축으로 나타납니다.
딥 인트로닉 변이가 새로운 exon을 만들거나 기존에 억제되던 exon을 활성화합니다. 보통 out-of-frame → NMD로 이어지며, ATM, BRCA2, DMD에서 여러 사례가 보고되었습니다.
Alt 5'SS 또는 alt 3'SS 변이로 엑손의 한쪽 경계가 바뀝니다. In-frame이면 단백질에 아미노산이 추가되거나 빠지고, out-of-frame이면 NMD로 이어질 수 있습니다.
하나의 변이가 여러 스플라이싱 결과를 동시에 만드는 경우입니다. 일부 전사체에서는 skipping, 다른 전사체에서는 retention이 생길 수 있어 유전자별 전사체 분석이 필요합니다.
| RNA 결과 | NMD 감수성 | 단백질 영향 | ACMG PVS1 적용 |
|---|---|---|---|
| Out-of-frame exon skipping | 대부분 YES | truncated protein (NMD 탈출 시) | PVS1 Very Strong 가능 |
| In-frame exon skipping | 아니오 | 도메인 결실, 기능 손실 가능 | PVS1 Moderate/Strong (도메인 중요도 따라) |
| Intron retention (PTC 도입) | 대부분 YES | truncated (NMD 탈출 시) | PVS1 Strong/Very Strong |
| Pseudoexon 삽입 (out-of-frame) | YES | NMD → LOF | PVS1 Strong |
| Exon extension (minor, in-frame) | 아니오 | 추가 아미노산 → 기능 변화 | 별도 평가 필요 |
| 증거 조합 | 분류 |
|---|---|
| PVS1 + PM2 + PP3 | Pathogenic |
| PVS1_Strong + PM2 + PP3 | Likely Pathogenic |
| PP3 + PM2 (PS3 없음) | VUS (P 경향) |
| BS3 (정상 스플라이싱 확인) | Likely Benign |
| BP7 + BA1 | Benign |